un genoma

Nature Genetics volume 55, pagine 54–65 (2023) Citare questo articolo

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L'identificazione dei geni e dei processi che mediano i segnali di associazione genetica per malattie complesse rappresenta una sfida importante. Poiché molti dei segnali genetici per il diabete di tipo 2 (T2D) esercitano i loro effetti attraverso la disfunzione delle cellule delle isole pancreatiche, abbiamo eseguito uno screening della perdita di funzione CRISPR in pool a livello genomico in una linea cellulare beta pancreatica umana. Abbiamo valutato la regolazione del contenuto di insulina come una lettura rilevante per la malattia della funzione delle cellule beta e identificato 580 geni che influenzano questo fenotipo. L'integrazione con dati genetici e genomici ha fornito supporto sperimentale per 20 trascrizioni effettrici T2D candidate, incluso il recettore dell'autofagia CALCOCO2. La perdita di CALCOCO2 era associata a mitocondri distorti, granuli immaturi contenenti meno proinsulina e accumulo di autofagosomi dopo l'inibizione dell'autofagia in fase avanzata. I portatori di varianti associate al T2D nel locus CALCOCO2 mostravano inoltre un'alterata secrezione di insulina. Il nostro studio evidenzia come gli schermi cellulari possono aumentare gli sforzi multi-omici esistenti per supportare la comprensione meccanicistica e fornire prove di effetti causali nei loci degli studi di associazione su tutto il genoma.

Gli studi di associazione sull’intero genoma (GWAS) hanno fornito migliaia di solide associazioni per il diabete di tipo 2 (T2D) e tratti correlati, ma la maggior parte si associa a regioni non codificanti con una probabile funzione regolatoria1. Una mappatura fine incompleta significa che la maggior parte dei loci GWAS non sono mappati su una singola variante causale ma piuttosto su più varianti in un insieme credibile, ognuna delle quali potrebbe potenzialmente influenzare l'espressione genica in un diverso contesto cellulare. Il passaggio tipico dopo la mappatura fine prevede il collegamento delle varianti presumibilmente causali e degli elementi regolatori ai geni che regolano, utilizzando metodi come la colocalizzazione dei loci dei tratti quantitativi di espressione cis (eQTL), la co-accessibilità della cromatina a singola cellula e i test di prossimità del DNA2,3 ,4,5. I limiti di questi approcci sono la dipendenza dal tipo cellulare e dal contesto (analisi condotte in tipi o stati cellulari inappropriati possono rivelare connessioni tra varianti e geni non correlate alla patogenesi della malattia) e la pleiotropia molecolare (varianti di interesse possono regolare la trascrizione di diversi geni in cis, oscurando l’identità della trascrizione causale). Questi approcci possono generare ipotesi sugli effettori candidati ma in genere non riescono a fornire prove definitive.

Gli studi sulle perturbazioni possono fornire prove più convincenti del rapporto causa-effetto, ma solo se si utilizzano modelli autentici e fenotipi rilevanti per la malattia6. La prova più forte deriva dalle varianti di codifica associate alla malattia che forniscono una lettura delle conseguenze delle perturbazioni della funzione genetica e proteica negli esseri umani, ma la bassa frequenza della maggior parte di tali varianti limita questo approccio2. I modelli cellulari umani e le tecnologie basate su CRISPR forniscono un’alternativa interessante per generare profili a livello dell’intero genoma delle conseguenze fenotipiche della perturbazione genetica e comprendere la biologia delle malattie6. Al centro di questa aspirazione c’è la fiducia nella rilevanza della malattia di un tipo di cellula. Per il T2D, sia le prove fisiologiche che quelle epigenomiche evidenziano il ruolo centrale delle isole pancreatiche, e di conseguenza delle cellule beta produttrici di insulina, nel mediare il rischio di malattia3,4,5,6,7. Differenze sostanziali tra roditori e isole o cellule beta umane suggeriscono l'uso di tessuti e linee cellulari umani8,9,10,11,12,13. Noi e altri abbiamo generato grandi risorse trascrittomiche ed epigenomiche in questo tessuto umano chiave consentendo l'integrazione dell'intero genoma di dati genetici e genomici per identificare le trascrizioni effettrici candidate nei loci GWAS T2D4,7,14,15. Ora integriamo queste risorse con uno schermo CRISPR della perdita di funzione (LoF) su tutto il genoma nella linea cellulare beta pancreatica umana ben caratterizzata EndoC-βH1 per identificare i geni che regolano il contenuto di insulina16,17,18. La linea cellulare EndoC-βH1 immortalata mostra una firma multi-omica simile alle cellule beta umane primarie sebbene con caratteristiche distinte che evidenziano l'origine fetale e trasformata della linea cellulare18,19. Sebbene il contenuto di insulina sia inferiore rispetto alle isole primarie, le cellule EndoC-βH1 dimostrano proprietà elettrofisiologiche e secretorie simili, rendendole un modello fisiologicamente rilevante per studiare la funzione delle cellule beta in vitro17,20,21,22.