Il DNA mitocondriale è un bersaglio dell'integrazione dell'HBV

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 684 (2023) Citare questo articolo

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Il virus dell’epatite B (HBV) può integrarsi nel genoma delle cellule infette e contribuire all’epatocarcinogenesi. Tuttavia, il ruolo dell’integrazione dell’HBV nello sviluppo del carcinoma epatocellulare (HCC) rimane poco chiaro. In questo studio, applichiamo un approccio di sequenziamento dell'integrazione dell'HBV ad alto rendimento che consente l'identificazione sensibile dei siti di integrazione dell'HBV e l'enumerazione dei cloni di integrazione. Identifichiamo 3339 siti di integrazione dell'HBV in campioni di tessuto tumorale e non tumorale accoppiati da 7 pazienti con HCC. Rileviamo 2107 integrazioni clonali espanse (1817 nei tessuti tumorali e 290 nei tessuti non tumorali) e un significativo arricchimento delle integrazioni clonali dell'HBV nel DNA mitocondriale (mtDNA) che si verificano preferenzialmente nei geni della fosforilazione ossidativa (OXPHOS) e nella regione del D-loop. Troviamo anche che le sequenze di RNA dell'HBV vengono importate nei mitocondri delle cellule dell'epatoma con il coinvolgimento della polinucleotide fosforilasi (PNPASE) e che l'RNA dell'HBV potrebbe avere un ruolo nel processo di integrazione dell'HBV nel mtDNA. I nostri risultati suggeriscono un potenziale meccanismo attraverso il quale l’integrazione dell’HBV può contribuire allo sviluppo dell’HCC.

L’infezione cronica da virus dell’epatite B (HBV) è un importante fattore di rischio per lo sviluppo del carcinoma epatocellulare (HCC). Rispetto agli individui sani, i pazienti con epatite cronica B (CHB) hanno un rischio fino a 100 volte maggiore di sviluppare l'HCC, che è la quarta causa principale di morte correlata al cancro in tutto il mondo, con circa 780.000 decessi/anno1,2. Il DNA virale integrato è stato rilevato nell'85-90% degli HCC correlati all'HBV e la sua presenza nei tumori che si sviluppano nel fegato non cirrotico di bambini o giovani adulti supporta ulteriormente il ruolo dell'integrazione del DNA virale nell'epatocarcinogenesi3,4,5, 6,7. L'integrazione del DNA dell'HBV nel genoma dell'ospite può portare a instabilità cromosomica, mutagenesi inserzionale, deregolamentazione dell'espressione genetica dell'ospite e produzione di proteine virali mutanti, come proteine di superficie troncata e proteine HBx con proprietà oncogene note8,9. Sebbene i siti di inserzione del DNA dell'HBV sembrino essere distribuiti casualmente in tutto il genoma dell'ospite, il recente utilizzo di approcci di sequenziamento di prossima generazione (NGS) ha portato all'identificazione dell'arricchimento dell'integrazione dell'HBV in specifici geni cancerogeni, tra cui TERT, MLL4, CCNE1 e CCNA2, nei tessuti tumorali7,10,11,12,13,14,15,16. Inoltre, uno studio recente ha dimostrato che alterazioni ricorrenti del numero di copie nei geni che determinano il cancro possono essere associate all'integrazione virale a distanza16. Sebbene sia stato studiato un numero significativo di casi, i geni noti correlati al cancro vengono alterati dall'integrazione dell'HBV solo in una piccola percentuale di HCC correlati all'HBV. Numerosi studi hanno inoltre dimostrato che specifici elementi genomici, come sequenze ripetitive, sequenze di DNA per RNA non codificanti e retrotrasposoni, sono presi di mira dall'integrazione dell'HBV7,11,12,14,17,18,19. Uno studio condotto a Hong Kong che ha analizzato le linee cellulari di HCC HBV-positive ha mostrato che l'espressione di uno specifico trascritto chimerico HBx-LINE1 ha una funzione di promozione del tumore, con un'ampia percentuale di HCC valutati che esprimono questo trascritto17. Tuttavia, l'espressione di HBx-LINE1 non è stata confermata in un'ampia serie di HCC correlati a HBV provenienti da pazienti europei20.

Nonostante i progressi compiuti dalla ricerca sull’integrazione del DNA dell’HBV, molti aspetti chiave rimangono poco chiari. Nel complesso, lo sviluppo di metodi di rilevamento alternativi per l'integrazione dell'HBV potrebbe aiutare a ottenere una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti nel processo cancerogeno indotto dall'integrazione dell'HBV.

Applicando un metodo di sequenziamento dell'integrazione dell'HBV (HBIS) ad alto rendimento, in questo studio abbiamo rilevato un arricchimento dell'integrazione del virus nel DNA mitocondriale (mtDNA) da tessuti epatici sia tumorali che non tumorali di pazienti con HCC. Inoltre, abbiamo applicato HBIS e RNASeq ai mitocondri purificati da cellule HepAD38 indotte da HBV e rilevato molteplici integrazioni di HBV nel mtDNA e trascrizioni di fusione HBV-mitocondriale. Tutte le integrazioni mitocondriali nei tessuti tumorali sono state espanse clonalmente e hanno coinvolto sia i geni mitocondriali della fosforilazione ossidativa (OXPHOS) che la regione del D-loop. Abbiamo anche scoperto che sequenze di RNA dell'HBV vengono importate nei mitocondri delle cellule dell'epatoma e che la polinucleotide fosforilasi (PNPASE) potrebbe essere coinvolta nell'importazione della trascrizione virale.

15 kb, with more than 20% having a length shorter than 100 bp31,46,55. Considering that mtDNA averages several thousand copies per hepatocyte compared to the two copies of numts in nuclear DNA (nDNA), by isolating mitochondria from cells, it is possible to completely dilute out numts, leading to numt-free mtDNA sequences. Therefore, to study mtDNA HBV integration, we isolated nuclei, cytoplasm, and mitochondria from HBV-producing HepAD38 cells and applied both HBIS and RNASeq. According to HBIS, several HBV integration sites were identified in DNA isolated from mitochondria, whereas no integration was detected in numts from nDNA. Furthermore, RNASeq revealed the presence of chimeric HBV-mitochondrial transcripts within mitochondria but not in cytoplasm or nuclei of HBV-producing HepAD38 cells, and mtDNA insertion sites may be transcriptionally active in these cells. Both HBIS and RNAseq analysis also revealed that MMEJ have a major role in HBV integrations occurring in mitochondrial genomes. Therefore, taken together, our data clearly demonstrate that HBV can integrate into mtDNA of tumour and non-tumour hepatocytes. Some previous studies have reported data concerning HBV integration in mtDNA16,56,57,58,59,60. All these studies have utilised high-throughput HBV genome-enrichment sequencing approaches to study HBV integration, and most of them have analysed hepatoma cell lines stably expressing HBV DNA56,57,58,59.To the best of our knowledge, only one16 of the papers has reported data on HBV integration in mtDNA from human liver tissues. In particular, in the supplementary dataset of this paper, 58 different HBV integration sites in mtDNA from tumour and/or non-tumour liver tissue specimens of 11 patients with HBV-related HCC have been listed16. The mitochondrial genomic regions most frequently targeted by HBV integration in the 11 patients were the D-loop region, ND4, ND5, RNR2, CYTB, ND6, ND1, ND2 and COX3 genes16. HBV integration events have also been described in mtDNA from humanised-liver tissue samples of chimeric mice60. In this study, Furuta et al.60 have identified 50 distinct HBV integration sites in mtDNA from chimeric mice. These integrations (a) have been associated with higher levels of HBV replication, (b) occurred at higher frequency in the D-loop region, and (c) appeared to rely on MMEJ60. No detailed information on virus-mtDNA junctions has been provided in studies performed on PLC/PRF/5 cell lines56,59. However, the fact that HBV integration in mtDNA may occur in these cells—which do not replicate HBV and only express multiple distinct viral RNAs from HBV integrants56,59—suggests that viral RNA might be involved in the process of HBV integration in mtDNA. Despite a number of studies documenting interaction between HBV proteins and mitochondria and consequent alteration of mitochondrial functions61,62,63, whether HBV nucleic acids may translocate into mitochondria has only minimally been addressed. Based on our results, HBV transcripts, but not viral full-length genome or cccDNA, can localise to mitochondria. In addition, PNPASE, a mitochondrial protein considered the first RNA import factor for mammalian mitochondria35,36,39, possibly mediates viral RNA delivery into the mitochondrial matrix. A PNPASE-dependent RNA import sequence that we identified for the preS1 transcript as well as known stem-loop structures specific to HBV transcripts appear to mediate mitochondrial targeting of viral RNAs. Localisation of HBV transcripts to mitochondria leads us to hypothesise that viral RNA may represent a possible substrate for HBV integration in mtDNA. The mitochondrial genome is more prone to damage and double-strand break (DSB) formation than the nuclear genome due to frequent exposure to the ROS generated by mitochondrial oxidative phosphorylation and the lack of protective histones. Considering that several reports have shown that RNA molecules can directly act as a template for the repair of mitochondrial DSBs in human cells64, it is tempting to speculate that viral exploitation of this pathway may lead to HBV sequences being inserted into the mitochondrial genome. In summary, we found that HBV may integrate into mtDNA, with tumours and non-tumour liver tissues showing distinct profiles of viral integration into the mitochondrial genome. Moreover, our results indicate that HBV RNA may be actively imported into mitochondria and that viral RNA sequences might be involved in the process of HBV integration into mtDNA. In spite of the relatively limited sample of patients, this study offers new insight into the HBV-hepatocyte interaction and provides a new basis for investigative analyses that may lead to further comprehension of the mechanisms by which HBV insertion can drive HCC development and progression./p> 5 exo− (5000 U/mL) (New England Biolabs, Ipswich, MA) for 1 h at 37 °C. All reactions were purified by a MinElute Reaction Clean-up kit (Qiagen). Each aliquot of blunted, A-tailed DNA fragments was then ligated to 200 pmol annealed linkers (LinkerTop + LinkerBottom) (Supplementary Table 2) with 4 μL pLinker, 5 μL NEB T4 DNA ligase buffer and 1 μL T4 DNA ligase (2 × 106 U/mL, high concentration) (New England Biolabs) for 1 h at 25 °C and then overnight at 16 °C. The ligase was inactivated by incubation at 70 °C for 20 min, and the reactions were purified using a MinElute Reaction Clean-up kit (Qiagen). Finally, all six reactions were pooled, and the pooled linker-ligated DNA was aliquoted into two equal parts to perform semi-nested ligation-mediated PCR with forward or reverse HBV primers (Fig. 1 and Supplementary Table 2). The forward and reverse enrichment sequences were kept separate throughout the remainder of the protocol. The DNA was divided into 1-µg aliquots; each aliquot was mixed with 20 µL Phusion HF buffer (5×), 3 μL dNTPs (10 mM), 1 μL biotinylated forward (20 μM) or reverse HBV primer (Supplementary Table 2) (2.5 μM), 1 μl Phusion Taq (2000 U/ml) (New England Biolabs) and H2O to 50 μL. Single-primer PCRs were performed as follows: 98 °C for 1 min; 12 cycles of 98 °C for 15 s, 65 °C for 30 s and 72 °C for 45 s; 72 °C for 1 min); and a hold at 4 °C. Each tube was then spiked with 1 μL pLinker (Supplementary Table 2) (2.5 μM) and subjected to additional cycles of PCR, as follows: 98 °C for 1 min; 35 cycles of 98 °C for 15 s, 65 °C for 30 s and 72 °C for 45 s; 72 °C for 5 min; and a hold at 4 °C. Forward and reverse PCRs were purified using the QIAquick PCR purification kit (Qiagen). The purified products were well separated on a 2% agarose gel, and fragments of 300–1000 bp were excised. The DNA was purified using a QIAquick gel extraction kit, and gel-based size selection and purification was repeated once. Then, 100 μL T1 magnetic streptavidin beads (Invitrogen) were added to each forward and reverse PCR product, and the mixture was incubated for 1 h with gentle rocking at room temperature. The beads were magnetically isolated, washed three times in 500 μL 1× B&W buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) and once in H2O and resuspended in 50 μL H2O. Subsequently, 25 μL of the beads from each of the forward and reverse PCRs were separately mixed with 10 µL Phusion HF buffer (5×), 1.5 μL dNTPs (10 mM), 1 μL forward (20 µM) or reverse MiSeq HBV primer (20 μM), 1 μL forward or reverse MiSeq-pLinker (20 μM) (all MiSeq primers contain an adaptor for Illumina flow cell surface annealing) (Supplementary Table 2), 0.5 μL Phusion Taq (2000 U/mL), and 11 μL H2O and subjected to PCR (98 °C for 1 min, 35 cycles of 98 °C for 10 s, 65 °C for 40 s, and 72 °C–40 s, followed by 72 °C for 5 min and a hold at 4 °C). The PCR products were magnetically separated from the beads and purified using the QIAquick PCR purification kit (Qiagen). The adaptor-ligated fragments were enriched by 25 cycles of PCR with Illumina primers Index 1 and Index 2, as follows: 98 C° for 1 min, 25 cycles of 98 °C for 30 s, 55 °C for 30 s, and 72 °C for 30 s), and 72 C° for 5 min. Forward and reverse libraries for the same sample were mixed in equimolar ratios and sequenced by 250-bp paired-end sequencing using an Illumina MiSeq. A total of 340 integration libraries were constructed from liver tissue samples of the nine individuals analysed (7 patients with HBV-related HCC and 2 HBsAg-negative subjects as a control) and from the PLC/PRF/5, HepAD38 and Vero cell lines./p>

3.0.CO;2-E" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1097-0142%28195405%297%3A3%3C462%3A%3AAID-CNCR2820070308%3E3.0.CO%3B2-E" aria-label="Article reference 24" data-doi="10.1002/1097-0142(195405)7:33.0.CO;2-E"Article CAS PubMed Google Scholar /p>

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