Rilevamento ultrasensibile e visivo del genotipo del norovirus umano GII.4 o GII.17 utilizzando CRISPR

Virology Journal volume 19, numero articolo: 150 (2022) Citare questo articolo

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L'integrazione dei sensori CRISPR-Cas12a con l'amplificazione del segnale isotermico può essere sfruttata per sviluppare test a basso costo, monouso e ultrasensibili per la diagnostica dei patogeni umani.

Sono stati esplorati test fluorescenti e a flusso laterale (LFS) mediati da RT-RAA-Cas12a in tempo reale o end-point per il rilevamento diretto del genotipo GII.4 o GII.17 del norovirus (NOV).

I risultati hanno mostrato che il nostro test fluorescente e LFS mediato da RT-RAA-Cas12a potrebbe rilevare NOV GII.4 o GII.17 prendendo di mira il gene della proteina virale 1. Il nostro test fluorescente e LFS mediato da RT-RAA-Cas12a è in grado di rilevare specificamente NOV GII.4 o GII.17 senza reattività crociata per altri virus correlati. Il limite basso di rilevamento potrebbe raggiungere 0,1 copie/μL in circa 30-40 minuti e i risultati sono stati visualizzati utilizzando un illuminatore a luce ultravioletta o su un LFS senza apparecchiature complesse. Inoltre, il nostro test fluorescente e LFS mediato da RT-RAA-Cas12a ha fornito un'alternativa visiva e più rapida al test RT-PCR in tempo reale, con una concordanza predittiva positiva del 95,7% e 94,3% e una concordanza predittiva negativa del 100%.

Insieme, il nostro approccio mediato da RT-RAA-Cas12a avrebbe un grande potenziale per la diagnostica point-of-care di NOV GII.4 e/o GII.17 in contesti con risorse limitate.

I norovirus umani (NOV) sono ora riconosciuti come la causa principale della maggior parte delle gastroenteriti non batteriche [1]. I NOV sono un gruppo di virus a RNA che possono causare sintomi come vomito acuto e diarrea che generalmente durano 48 ore sia in bambini che in adulti altrimenti sani. I NOV sono altamente contagiosi, poiché anche poche particelle possono causare malattie e gli individui infetti diffondono elevate quantità di virus [2, 3]. I NOV vengono trasmessi principalmente agli esseri umani attraverso l'esposizione a cibi e acqua contaminati a seguito del contatto diretto o indiretto con feci umane infette da NOV [4] o all'interno di aerosol generati dal vomito di individui infetti [5]. Come risultato dell’elevata infettività dei NOV e della loro capacità di trasmissione efficiente, epidemie di NOV sono state segnalate a livello globale in contesti di comunità chiuse, inclusi ospedali e case di cura, e quindi richiedono misure di intervento per ridurre l’infezione aggressiva [6].

I norovirus umani possiedono un’immensa diversità genetica con dieci diversi genogruppi (GI-GX) e almeno 48 genotipi identificati [7]. È noto che i genogruppi GI, GII e GIV dei NOV sono associati all'infezione umana. Tra i circa 21 genotipi di NOV GII, il genotipo GII.4 è stato responsabile della maggior parte dei casi clinici di infezione rivoluzionaria di NOV negli ultimi dieci anni [8]. Recentemente, un nuovo genotipo GII.17 di NOV è emerso e si è diffuso rapidamente fino a diventare il ceppo dominante di NOV in alcune parti dell’Asia, ponendo il rischio di ulteriori minacce di epidemie [9]. Fino ad ora, a parte solo pochi rapporti sull’efficacia del trattamento antivirale negli esseri umani [10], non è disponibile alcun vaccino NOV autorizzato per gli esseri umani [11]. Di conseguenza, una rilevazione più rapida e precoce dell’infezione da NOV svolge un ruolo significativo nel facilitare l’intervento precoce, il trattamento e la prevenzione dell’infezione, che, a sua volta, può mitigare il rischio di trasmissione del virus infettivo.

L’attuale gold standard per la rilevazione dei NOV sono le tecniche molecolari che includono la reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa (RT-PCR), la RT-PCR annidata e la RT-PCR in tempo reale [12]. Tra questi metodi, la RT-PCR in tempo reale è stata ampiamente utilizzata per rilevare o diagnosticare l’infezione da NoV grazie alla sua elevata sensibilità e specificità, nonché al basso rischio di contaminazione da carry-over. Attualmente, vari test RT-PCR in tempo reale disponibili in commercio hanno dimostrato la sensibilità della RT-PCR in tempo reale a 10-50 copie/reazione del genoma per NoV GI e 1-300 copie/reazione del genoma per NoV GII [13]. Tuttavia, il metodo RT-PCR in tempo reale si basa in genere su apparecchiature sofisticate e personale altamente qualificato e ha un tempo di reazione medio di ~ 2 ore, il che non è adatto per operazioni semplici, rapide e presso il punto di cura (POC ) test molecolare per la diagnosi dell'infezione da NOV in aree con risorse limitate per il rilevamento di routine. In uno studio recente, Sun et al. hanno presentato un metodo colorimetrico basato su carta per rilevare e distinguere i genotipi GII.4 e GII.17 di NOV [14]. Tuttavia, il test utilizzando questo metodo richiede un tempo relativamente lungo (~ 3 ore) e l'intervallo di rilevamento è limitato tra 2,6 fM e 0,5 pM, ed è quindi meno sensibile rispetto alla RT-PCR [14]. Al contrario, grazie all'eccellente rapidità, sensibilità e specificità, il sistema di rilevamento degli acidi nucleici basato su nucleasi cluster guidato da RNA, costituito da brevi ripetizioni palindromiche regolarmente interspaziate (CRISPR) e dalle relative nucleasi associate a CRISPR (Cas), ha recentemente mostrato un notevole potenziale per sfruttare la diagnostica molecolare POC di prossima generazione per i patogeni infettivi [15,16,17]. Attualmente, l’efficacia di diverse versioni di nucleasi Cas, tra cui Cas12a, Cas12b, Cas13a e Cas14, è stata valutata sia in test in vitro che in vivo [18,19,20,21]. Tra queste nucleasi, Cas12a (precedentemente Cpf1) è un'endonucleasi di tipo V di classe II. Cas12a contenente un dominio nucleasi RuvC viene introdotto da un singolo CRISPR RNA (crRNA) contenente una sequenza PAM (protospacer-adiacente) ricca di T per scindere il DNA a doppio filamento (dsDNA) in un sito specifico, o senza PAM per eseguire la scissione non specifica di ssDNA in trans in vitro [18]. Inoltre, la combinazione delle nucleasi Cas12a con l’amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA) o la trascrizione inversa-RPA (RT-RPA) è stata esplorata a fondo per sviluppare il sistema DETECTR (DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter) e migliora significativamente la sensibilità e la specificità del rilevamento dell’acido nucleico. 18].